1、樣品預(yù)處理方法

樣品預(yù)處理應(yīng)包括進(jìn)樣前的一切操作。除了稱(chēng)重、溶解、稀釋等步驟外,樣品需要: ①過(guò)濾; ②萃取; ③衍生化(柱前衍生) ; ④液相色譜(低壓柱層析) 。這些操作可以是手工進(jìn)行或?qū)嵭凶詣?dòng)化操作。樣品預(yù)處理的目的是除去干擾物、增加檢測(cè)器靈敏度(富集) 、保護(hù)色譜柱等。樣品預(yù)處理同時(shí)也是為了避免色譜分離故障,其中樣品萃取是關(guān)鍵的一步,要從大量的干擾物中萃取出微量組分難度極大。
有些樣品經(jīng)預(yù)處理后還不能作進(jìn)樣分析,需進(jìn)行衍生化處理,使一些無(wú)紫外吸收或無(wú)熒光的組分,經(jīng)過(guò)衍生化后能用紫外和熒光檢測(cè)器檢測(cè),這樣既提高了靈敏度,又改善了分離度(質(zhì)量變化) 。樣品預(yù)處理的同時(shí)也會(huì)帶來(lái)一些問(wèn)題,如樣品損失、樣品被污染、衍生化反映不完全或多種反應(yīng)物生成等。衍生反應(yīng)常會(huì)影響試驗(yàn)的精確度,或者在整個(gè)樣品預(yù)處理過(guò)程中帶來(lái)誤差。
用于液相色譜分析的樣品溶液必須均勻而無(wú)顆粒,有顆粒會(huì)損壞進(jìn)樣器并阻塞柱頭。處理好的樣品在準(zhǔn)備上柱前應(yīng)對(duì)準(zhǔn)光線(xiàn)搖動(dòng),檢查樣品溶液中有無(wú)顆粒。只要看到顆粒、混濁或乳化,就應(yīng)過(guò)濾一下,過(guò)濾膜要能截留住015μm 以上的顆粒,樣品過(guò)濾的過(guò)程中可能引起:樣品被污染,因過(guò)濾吸附降低樣品組分的含量,樣品溶劑揮發(fā)引起誤差。萃取的目的是從共溶的樣品介質(zhì)中分離出被分析的組分,或者減少損壞柱的物質(zhì)(如蛋白質(zhì)等)和干擾物。一般采用有機(jī)溶劑萃取,要求萃取用的溶劑毒性低、揮發(fā)性好、雜質(zhì)少、對(duì)待測(cè)樣品有良好的溶解度且又與水不相混溶。常用的有乙醚、醋酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯或者兩種以上的混合溶劑。萃取后一般可直接進(jìn)樣,有時(shí)需要濃縮或吹干濃縮,再用定體積的液體或流動(dòng)相溶解進(jìn)樣。這樣增加了樣品濃度,提高了靈敏度,同時(shí)避免了溶劑峰對(duì)樣品峰的干擾。在萃取是要考慮樣品分子的溶解能力。除了脂溶性和水溶性組分外,還有用脂溶性的組分制成水溶性的鹽。萃取方法如下:

1.1 　水溶性樣品

(1) 酸性組分及生成的鹽萃取方法:有機(jī)溶劑萃取雜質(zhì)后調(diào)成酸性,再加有機(jī)溶劑萃取或進(jìn)樣,或在N2 流下吹干,用適當(dāng)?shù)娜軇┙夂筮M(jìn)樣。
(2) 堿性組分及生成的鹽萃取方法:有機(jī)溶劑萃取雜質(zhì)后調(diào)成堿性,再加有機(jī)溶劑萃取或進(jìn)樣,或在N2 流下吹干,用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙夂筮M(jìn)樣。
(3) 中性組分萃取方法:有機(jī)溶劑萃取雜質(zhì)后,直接用反相色譜法分析。

1.2 　脂溶性組分萃取方法:

有機(jī)溶劑萃取或進(jìn)樣,或在N2 流下吹干,用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙夂筮M(jìn)樣。
2 　分析中的污染

一般檢測(cè)的環(huán)境、容器、試劑都是影響測(cè)定結(jié)果的因素。

2.1 　環(huán)境污染
儀器室的有害氣體、氣溶液、灰塵等等都能造成污染,影響檢測(cè)結(jié)果,這種污染很難校正。因此,儀器室與其他實(shí)驗(yàn)室應(yīng)隔離,保持清潔,儀器室內(nèi)應(yīng)安裝空調(diào),注意防潮、防腐、防震、空氣相對(duì)濕度應(yīng)小于70 %為宜。

2.2 　容器
實(shí)驗(yàn)室常用的器皿有玻璃類(lèi)、瓷類(lèi)、石英類(lèi)、塑料類(lèi)等,在進(jìn)行分析時(shí),應(yīng)按照待則樣品的要求來(lái)選則器皿,不管使用哪種器皿,容器的洗條清潔都是很重要的,也是取得好的檢測(cè)結(jié)果的基本保證。

2.3 　試劑
在液相色譜分析中,所選用的試劑必須是色譜純、優(yōu)級(jí)純或分析純,如果用含量有雜質(zhì)的試劑,則會(huì)出現(xiàn)雜峰而影響測(cè)定結(jié)果。
3 　標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

在配置標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí),先要配置現(xiàn)定濃度的內(nèi)標(biāo)溶液,在標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中最好使用同一批次配制的內(nèi)標(biāo)溶液以減少誤差。
       (1) 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)應(yīng)當(dāng)是色譜純的、性質(zhì)穩(wěn)定。
       (2) 常用的標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)存放在棕色溶液瓶中低溫保存。
       (3) 在配制維生素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),要放置在棕色容量瓶中或避光放置以免分解。
4 　樣品預(yù)處理過(guò)程中的主要故障與解決辦法

(1) 色譜圖中出現(xiàn)無(wú)關(guān)的峰,原因有可能是樣品過(guò)濾器帶來(lái)污染,解決方法如下:

①將過(guò)濾器浸泡在樣品溶劑中并進(jìn)樣試驗(yàn); ②改變過(guò)濾器類(lèi)型; ③采用交替清洗技術(shù)。
       (2) 一些或全部化合物的峰比預(yù)期的小,尤其是低濃度的樣品,原因可能是樣品過(guò)濾器表面吸附下降,解決方法如下:①改變過(guò)濾器類(lèi)型; ②嚴(yán)格按相同條件處理所用樣品; ③采用交替清洗技術(shù)。
       (3) 回收率太低或差,原因可能是萃取不完全,解決方法如下:①增加萃取時(shí)間,使用熱溶劑; ②修改清洗方法。
       (4) 色譜峰變寬,柱壽命縮短,原因可能是樣品帶來(lái)的干擾與污染,應(yīng)改進(jìn)清洗方法。
       (5) 精度差,原因可能是回收不完全,解決方法如下:

①改進(jìn)或替換衍生化、分離、萃取或其他條件;

②用自動(dòng)化處理裝置提高精度。